PRODUITS
FAQ
Questions concernant l’utilisation des gels UltraPag® et problèmes rencontrés le plus fréquemment en électrophorèse de protéines.
Préparation et montage des gels UltraPag®
| Observation ou problème rencontré | Cause | Réponse |
|---|---|---|
| Après ouverture du sachet protecteur, le gel présente un aspect opaque. | Conservation dans le temps. | L’opacité du gel n’affecte en rien la migration et le profil protéique obtenu. |
| Fuites du tampon de migration de la chambre interne. | Mauvais positionnement de la cassette dans le montage. | Vérifier que la cassette soit posée dans le bon sens sur le gel ; les encoches situées en partie haute de la cassette doivent être orientées vers l’extérieur, en correspondance avec le joint de la cuve.
Vérifier que l’assemblage gel-cassette soit bien encastré sur le support de la cuve à électrophorèse. |
| Courant faible ou absent durant la migration. | Circuit incomplet. | Vérifier que les puits soient bien immergés dans le tampon.
Vérifier que les connections électriques soient intactes et bien fixées. |
| Durée de la migration trop longue. | Tampon de migration trop concentré.
Niveau de tampon insuffisant. | Refaire du tampon de migration 1x selon les instructions fournies avec le tampon Zeta Biotech.
Vérifier l’assemblage gel-cassette pour qu’il n’y ait pas de fuite de la chambre interne. Veiller à ce que les niveaux de tampon dans les chambres interne et externe soient suffisants. |
| Migration trop rapide / Faible résolution. | Tampon de migration trop dilué.
Paramètres de migration excessifs. | Refaire du tampon de migration 1x selon les instructions fournies avec le tampon Zeta Biotech.
Diminuer le voltage ou le courant de 25-50%. |
Problèmes majeurs rencontrés en électrophorèse de protéines
| Observation ou problème rencontré | Cause | Réponse |
|---|---|---|
| Profil protéique non linéaire. | Le temps de réhydratation du gel UltraPag® n’a pas été respecté. | Une durée de réhydratation inférieure à 30 min peut compromettre le résultat final. Respecter les indications fournies avec le gel Ultra PAG® . |
| Présence de « smears » – Front de migration normal. | Echantillon protéique trop riche.
Dénaturation des échantillons incomplète. Présence de protéases dans l’échantillon. Présence de sels en quantité excessive dans les échantillons. | Déposer sur le gel des quantités d’échantillon protéique de valeurs inférieures à 40µg.
Chauffer les échantillons dans le tampon de charge 5 min à 100°C afin de permettre la dissociation des sous-unités protéiques. Conserver les échantillons au froid avant de les dénaturer et de les déposer dans les puits ou utiliser un inhibiteur de protéases comme le PMSF. Réduire la concentration en sels par dialyse ou gel filtration. |
| Présence de « smears » – Vitesse du front de migration altérée ou « smear » du front de migration. | Paramètres de migration non optimisés.
Présence de sels en quantité excessive dans les échantillons. Précipitation de l’échantillon. Présence de contaminant (membranes ou ADN) dans l’échantillon. Tampon de migration inadapté. | La plupart des gels migrent à 5-20 V/cm.
Réduire la concentration en sels par dialyse ou gel filtration. Augmenter la concentration en SDS de l’échantillon pour maintenir la solubilité de la protéine. Centrifuger l’échantillon afin d’éliminer les particules contaminantes. Préparer un nouveau tampon de migration 1x selon les instructions Zeta Biotech. |
| Front de migration diffus. | Solutions tampon conservées trop longtemps. | Préparer un nouveau tampon de charge. Le tampon de charge Zeta Biotech se conserve au maximum 30 jours à 4°C après réhydratation.
Préparer un nouveau tampon de migration 1x selon les instructions Zeta Biotech. |
| « Smiling ». | Le gel chauffe durant la migration.
Tampon de migration inadapté | Modifier les paramètres de migration ou adapter un système d’échange de chaleur à la cuve à électrophorèse.
Préparer un nouveau tampon de migration 1x selon les instructions Zeta Biotech. |
| Bandes doubles. | Dégradation par les protéases ou oxydation des échantillons.
Dénaturation incomplète. | Conserver les échantillons au froid avant de les dénaturer et de les déposer dans les puits ou utiliser un inhibiteur de protéases comme le PMSF.
Ajouter du mercaptoéthanol ou du DTT au tampon d’échantillon si une oxydation est suspectée. Chauffer les échantillons dans le tampon de charge 5 min à 100°C afin de permettre la dissociation des sous-unités protéiques. |
| Bandes attendues non visibles. | Digestion protéasique des échantillons.
Gel inadapté. | Conserver les échantillons au froid avant de les dénaturer et de les déposer dans les puits ou utiliser un inhibiteur de protéases comme le PMSF.
Redéfinir la taille des pores des gels. |
| Bandes peu visibles. | Mauvaise coloration
Concentration protéique surestimée. Agitation insuffisante. Volume de la solution de coloration trop faible. | Vérifier les solutions et les procédures de coloration.
Augmenter le temps de développement pour la coloration à l’Argent ; réduire le temps de décoloration pour la coloration au Bleu de Coomassie. Augmenter la concentration protéique en fonction de la sensibilité de la procédure de coloration utilisée. Mettre le gel sous agitation pendant la coloration. Le gel doit être complètement recouvert par la solution pendant la procédure de coloration. |
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